Diversidad genética de la abeja Exaerete smaragdina (Guérin, 1844) (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) en el suroccidente colombiano

Área de estudio

Se muestrearon diez bosques naturales conservados en cuatro municipios del departamento del Cauca, dos en el flanco occidental de la cordillera Central (Sucre y Guachicono-Bolívar) y dos (Santa Rosa y Piamonte) en el flanco oriental de la cordillera “Centro-oriental”. Esta última denominación se hace por conveniencia, debido a que las localidades de estudio se ubicaron en el área conocida como piedemonte Andino-amazónico, antes de la bifurcación de la cordillera Central y Oriental. Asimismo, se obtuvieron cuatro muestras del municipio de Buenaventura en el flanco occidental de la cordillera Occidental, litoral Pacífico del departamento del Valle del Cauca, donde se muestreó un bosque natural conservado (Figura 1, Tabla 1).

Figura 1: Ubicación de los puntos de recolecta de Exaerete smaragdina.

Recolecta de material biológico

En cada bosque muestreado se trazaron dos transectos de 250 m x 2,5 m con estaciones para la recolecta cada 50 m. Para la recolección de machos de la tribu Euglossini, en cada estación se ubicaron siete trampas tipo botella PET con dos agujeros laterales que contenían alcohol al 96 % y cebadas con diferentes atrayentes: salicilato de metilo, eucaliptol, escatol, vainillina, eugenol, β-ionona y 1-3 dimetroxibenceno, para un total de 42 trampas. Cada una de ellas fue cebada a las 07:00 y recebada a las 12:00 horas durante tres días. El muestreo se complementó con la instalación de seis trampas Van Someren-Rydon (cada 50 m), cebadas con pescado descompuesto, expuestas durante 10 horas continuas para la recolecta de ejemplares hembra y con muestreos esporádicos de 60 min con red entomológica. Todo el material recolectado fue rotulado y almacenado en viales con alcohol al 96 % hasta su análisis taxonómico y molecular.

Identificación de las muestras

El tratamiento taxonómico, basado en caracteres morfológicos, siguió la clave para euglosinos de Colombia de Bonilla y Nates (1992) y para especies de Exaerete de Engel (2018). Todos los especímenes fueron depositados en la Colección de Entomología del Museo de Historia Natural de la Universidad del Cauca (MHNUC). Las muestras de 19 ejemplares identificados como Exaerete smaragdina fueron procesadas para la amplificación del gen mitocondrial COI. Se garantizó un ejemplar voucher por cada individuo procesado depositado en la Colección de Entomología del MHNUC.

Amplificación del gen mitocondrial COI

Las patas traseras y/o el músculo torácico de 19 individuos machos (15 de las localidades del departamento del Cauca y 4 ejemplares del departamento del Valle del Cauca) se utilizaron para la extracción de ADN siguiendo el protocolo de salting out (Birungi & Munstermann, 2002). Para la amplificación del gen mitocondrial COI, se usaron los cebadores universales LCO1490: 5'-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3' y HCO2198: 5'-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3' (Folmer et al., 1994). Cada reacción de PCR tuvo un volumen final de 25 μl, compuesto por 2 μl de ADN, buffer 1X, 2 μM de MgCl₂, 0,25 μM de cada cebador, 0,05 μM de dNTPs y 1 unidad de Taq ADN polimerasa (Invitrogen), en las condiciones de termociclado propuestas por Folmer et al. (1994), con ligeros ajustes en las temperaturas de desnaturalización y anillado o templado (94 y 42 °C, respectivamente). Aunque el autor propone 35 ciclos, se realizaron 40, lo cual permitió obtener bandas limpias y de buena calidad para la lectura de la electroforesis. Los amplificados se enviaron al Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de México para su secuenciación tipo Sanger en ambos sentidos.

Alineamiento múltiple, edición de secuencias y análisis

Los análisis genéticos se restringieron a secuencias de entre 500 y 700 pares de bases revisadas manualmente en los electroferogramas. La secuencia consenso se obtuvo usando el programa Sequencher versión 4.1.4 (Gene Code Corporation 1991-2002). Se realizó el alineamiento múltiple de las secuencias de interés junto a la secuencia completa del gen COI reportada en GenBank (EU421457) (Ramírez et al., 2016), utilizando el programa Geneious 7.1.3 (Biomatters Ltd. 2005-2014). Se construyeron las redes de haplotipos usando el programa Network 10.0.0 (Fluxus Technology Ltd. 1999-2024).

Con el programa Arlequín 3.5 (Excoffier & Lischer, 2010) se estimó la diversidad genética y se realizó el análisis de varianza molecular (AMOVA) para determinar los componentes de varianzas genéticas entre grupos y dentro de las poblaciones de las subzonas de estudio. La diferenciación en la estructura genética se realizó con los estadísticos F_ST (Wright, 1951). Con el programa DnaSP v6 (Rozas et al., 2017) se hicieron las pruebas de neutralidad D-Tajima y FS de Fu, diversidad haplotípica “h”, número de haplotipos y diversidad nucleotídica 𝜋. Se estimó una matriz de distancias genéticas a partir de Neighbor Joining en el programa Mega X (Kumar et al., 2018), usando el método de sustitución nucleotídica de Kimura 2-parámetros, debido al tamaño de la muestra y la naturaleza de los datos. Todas las pruebas estadísticas se realizaron con un nivel de significancia del 5 %.

Caracterización molecular, diversidad y estructura genética de E. smaragdina

Del total de las muestras procesadas para la caracterización de un fragmento de COI se obtuvieron secuencias para 14 individuos de E. smaragdina de cuatro localidades: Guachicono, en el flanco occidental de la cordillera Central (1); Santa Rosa (9) y Piamonte (3), en el flanco oriental de la cordillera Centro-oriental (piedemonte andino-amazónico); y el Valle en el litoral Pacífico (1). Las otras secuencias no se incluyeron en los análisis moleculares, debido a que no fueron secuencias de buena calidad. Al compararlas con las secuencias reportadas en GenBank, los porcentajes de similitud variaron entre 98,62 % y 100 %, confirmando su asignación a E. smaragdina. Un macho (código molecular CBAb0051) recolectado el 17 diciembre de 2018 en La Sonora, Piamonte (Cauca), fue genéticamente distante (5,07-5,92 %) a lo reportado para los individuos de E. smaragdina (0,16-1,7%) e identificado posteriormente como E. lepeletieri (Oliveira y Nemésio, 2003) por Roubik. Según Lanteri (2007), Packer et al. (2008) y Sheffield et al. (2009), los porcentajes de divergencia de ADNmt entre especies de artrópodos son mayores al 3 %. Por tal razón, esta secuencia se excluyó de los análisis de estructura genética. La secuencia del ejemplar de E. lepeletieri se publicó en la plataforma GenBank con código “OR 225120.1”, y su ejemplar voucher se encuentra depositado en la colección del MHNUC:EN:012835.

Figura 2: Red de haplotipos del gen COI para individuos macho de la especie Exaerete smaragdina en once bosques naturales conservados.

Figura 3: Representación gráfica de las distancias genéticas entre individuos de Exaerete smaragdina.

Notas. Método de Neighbor Joining, usando el modelo de sustitución Kimura 2-parámetros.

Se evidenció la existencia de siete haplotipos diferentes (Figura 2, Tabla 2). Los análisis de la red de haplotipos mostraron la presencia de estructura genética con referencia al marcador (COI) y soportado por las distancias genéticas (Figura 3), donde además se evidenció la presencia de tres poblaciones: una conformada por individuos colectados en el flanco oriental de la cordillera Centro-oriental (Santa Rosa y Piamonte) con los haplotipos H05, H07, H04, H52, que exhibieron relaciones filogenéticas más cercanas y conforman una sola población; otra representada por un individuo colectado en el flanco occidental de la cordillera Central (Guachicono) con el haplotipo H17, separado de la anterior por la presencia de la Cordillera Central, y una última población representada por un individuo del litoral Pacífico (Valle del Cauca) con el haplotipo H13, apartado de las poblaciones anteriores por la presencia de la cordillera Occidental, la cual no fue objeto de estudio.

Todas las localidades presentaron haplotipos diferentes (Figura 3). La mayor riqueza se presentó en el flanco oriental de la cordillera Centro-oriental, donde se obtuvieron cinco haplotipos diferentes: H51 y H52 en Santa Rosa y H05, H07 y H04 en Piamonte (Tabla 2). Entre los haplotipos, H05 fue el más frecuente, con presencia en ocho individuos analizados. En contraste, H17 y H13 fueron encontrados, cada uno, en un solo individuo, en una de las localidades muestreadas en el flanco occidental de la cordillera Central y en la localidad ubicada en la cordillera Occidental. Su poca frecuencia (singletones) en los individuos analizados obedece a la baja recolecta de ejemplares de Exaerete para esas regiones a pesar del esfuerzo de muestreo (Tabla 2, Figura 4). En este sentido, Silva (2009) sugiere que una pequeña muestra para cada localidad puede influenciar los resultados, dada la tendencia a observar menos representatividad de los polimorfismos en muestras pequeñas que en muestras grandes, lo que reduce la capacidad de identificar fuerzas evolutivas determinísticas atenuantes.

En general, la red presenta una configuración tipo estrella en la cual H05 (haplotipo más frecuente) está centralizado con diversos haplotipos que evolucionaron a partir de él, en más de un paso mutacional, mientras que H17 y H13 registraron 7 y 11 pasos mutacionales, respectivamente, con relación a H05. Por su parte, H07 solo fue registrado en un individuo, con un paso mutacional; H52 en tres individuos, con tres cambios mutacionales; mientras que H04 mostró dos respecto a H05. Para el caso del único individuo que exhibió el haplotipo H51, se evidencia un cambio de 32 pasos mutacionales con respecto al H05 (Tabla 2, Figura 2).

Se obtuvo una matriz final de 14 taxones y 632 posiciones, con 589 sitios conservados y 44 posiciones variables. La composición nucleotídica osciló entre 31,64 % y 31,91 % para timina y entre 46,32 % y 46,84 % para adenina. Esta es una configuración típica en el ADN mitocondrial en himenóptera (Arias et al., 2003). Silva (2009) reportó valores similares de composición nucleotídica para muestras de E. smaragdina.

En los análisis moleculares posteriores se consideró a Santa Rosa y Piamonte, ubicados en la vertiente oriental de la cordillera Centro-oriental, como una sola población. Por otro lado, debido al tamaño de la muestra de la subzona de Guachicono (vertiente occidental de la cordillera Central) no se interpretaron los análisis de diversidad genética y, por tanto, no se hizo ninguna inferencia de lo que ocurre con la dinámica poblacional de esta localidad.

Figura 4: Distribución de los haplotipos encontrados en las muestras analizadas de Exaerete smaragdina.

Notas. Elaboración: Yamid Mera.

El AMOVA reveló que más de tres cuartos de la variación genética la aportan las diferencias entre las poblaciones de estudio (84,52 %), mientras que la variabilidad dentro de las poblaciones representó el 15,48 % (Tabla 3). Esto soporta la idea de un posible aislamiento genético de las poblaciones por efecto de la barrera geográfica representada por la cordillera Central. El valor 𝜃 𝑆𝑇 para la población estudiada fue altamente significativo ( 𝜃 𝑆𝑇 =0,845; valor p < 0,0001, calculado con 1023 permutaciones), lo que, según la tabla de interpretación de Wright (1965), se considera una alta diferenciación genética entre poblaciones y soporta la idea de un alto grado de aislamiento genético entre las poblaciones estudiadas. Para el AMOVA se excluyó la población del litoral Pacífico debido a que la influencia de la cordillera Occidental no es objeto de estudio para este trabajo. En general, el análisis de diversidad (Tabla 4) mostró un polimorfismo bajo, de 0 % en Santa Rosa a 5,1% en Piamonte.

Ante los valores de las pruebas de neutralidad D-Tajima y FS de Fu (Tabla 5), es plausible sugerir que entre las localidades que conforman la población Santa Rosa y Piamonte, ubicada en el flanco oriental de la cordillera Centro-oriental, probablemente, pueden haber ocurrido dos cosas: la existencia de un exceso de alelos raros o la existencia de un patrón recurrente de expansión poblacional debido probablemente a un cuello de botella. Sin embargo, considerando el tamaño de muestra, estos resultados deben ser interpretados con cautela. No es posible inferir cuál de estas dos hipótesis explica lo que pasó en esta población hasta contar con nuevas pruebas o estudios que incluyan un mayor tamaño muestral. De igual manera, Silva (2009) reportó en su estudio que no existe soporte estadístico para ambas pruebas de neutralidad para los genes evaluados (16S, COI y Cyt B) en muestras de E. smaragdina. Esto le permitió postular la hipótesis de una evolución neutral para las poblaciones de esta especie y sugerir que las poblaciones objeto de su estudio no habían sufrido un evento de expansión o retracción demográfica reciente.

Aunque en la Bota Caucana los procesos que originan fragmentación (p. ej., desforestación y extracción de recursos naturales y mineros) fueron vetados durante la época de presencia de grupos al margen de la ley, en la actualidad tienen vía libre (observación personal). Esto constituye una preocupación constante ya que los diferentes grupos biológicos de la zona quedan vulnerables a la degradación del ecosistema natural y a la pérdida de conectividad (Primack et al., 2001). El escenario amenaza la persistencia local de las poblaciones de las abejas de las orquídeas debido a que, para mantener el flujo de genes, prevenir la endogamia y disminuir el riesgo de extinción, los euglosinos dependen de la dispersión, la conectividad funcional del paisaje, la disposición espacial de los diferentes hábitats, la distribución espacial de las poblaciones y el impacto de los hábitats en los organismos (Tonhasca et al., 2003; Zayed, 2009; Zimmermann et al., 2011; Suni & Brosi, 2012; Suni et al., 2014). En este escenario, la principal amenaza genética para las abejas provendría de la pérdida de diversidad genética asociada al declive del tamaño poblacional, agravada por un flujo génico limitado o discontinuo (Frankham et al., 2002; Frankham, 2003; Suni et al., 2014; Penha et al., 2015; Rosa et al., 2016).

Es factible que el continuo de bosques naturales conservados que forman parte del corredor biológico andino-amazónico haya favorecido el intercambio de haplotipos entre las poblaciones del flanco oriental de la cordillera Central (Santa Rosa y Piamonte en el departamento del Cauca). Esta situación permite explicar la red de haplotipos a través del comportamiento ecológico de las abejas euglosinas. Exaerete es un género de abejas solitarias de gran tamaño corporal, lo cual está ligado a su alta capacidad de vuelo. Los machos de E. frontalis, por ejemplo, pueden sobrevolar áreas con promedios de 40 ha y altitudinalmente cerca de los 2000 m s. n. m., teniendo como base su sitio de forrajeo (Roubik & Hanson, 2004). Según Pokorny et al. (2015), esta situación responde a que los machos no están obligados a permanecer en un sitio específico hasta encontrar un lugar adecuado para su establecimiento, por lo cual los obstáculos naturales moderados (pasturas, grandes cuerpos de agua, colinas o valles) no influyen en sus movimientos (Tonhasca et al., 2003). Ante la ausencia de barreras u obstáculos naturales extremos, una interconexión adecuada de las áreas (como lo es un corredor biológico) que garantice la oferta de recursos florales facilitaría la dispersión de los agentes polinizadores y visitantes euglosinos, característica que resalta el papel de las abejas de las orquídeas como polinizadoras en largas distancias (Suni et al., 2014; Pokorny et al., 2015).

Tonhasca et al. (2003) sugieren que los obstáculos naturales más extremos (altitudes por encima del rango de distribución y el área de paisaje alterado o antropizado) y las características ecológicas propias de cada especie pueden limitar la movilidad de estas abejas. En este sentido, la distribución altitudinal del género Exaerete para Colombia (0-2650 m s. n. m.), según el reporte de Ramírez et al. (2002), así como los hábitos ecológicos especializados, representan una limitante a la hora de mantener el flujo génico entre las poblaciones a lados opuestos de la cordillera. Esto conduce al aislamiento reproductivo por barreras geográficas y, por ende, al establecimiento de linajes independientes. Esta situación explica la presencia de haplotipos diferentes y distantes del haplotipo central para las poblaciones de los flancos occidentales de las cordilleras Central (Guachicono, Cauca) y Occidental (Buenaventura, Valle del Cauca), con respecto a la población del flanco oriental de la cordillera Centro-oriental (Santa Rosa y Piamonte). Aunque los muestreos abarcaron diferentes zonas de vida desde los 40 hasta los 2373 m s. n. m., los individuos solo se obtuvieron en un rango altitudinal entre 40 y 1194 m s. n. m. en un bosque seco tropical (Bs-T) del flanco occidental de la cordillera Central (Guachicono) y en el bosque muy húmedo tropical (Bmh-T) en Santa Rosa, Piamonte y Buenaventura.

En la Bota Caucana los diferentes ecosistemas presentan condiciones microclimáticas variables que favorecen la adaptación y el establecimiento de E. smaragdina como poblaciones independientes y aisladas reproductivamente. Aunado a esto, se debe reconocer que la presencia de una matriz antrópica en las partes altas de los flancos occidental y oriental de la cordillera Central puede limitar el intercambio genético entre las poblaciones de ambos lados de la cordillera. A su vez, esto favorece la diferenciación o la estructura genética entre las localidades evaluadas, pues los hábitos ecológicos de E. smaragdina la restringen a amplias zonas de continuos boscosos con altos niveles de conservación (Roubik & Hanson, 2004; Roubik, 2019).

En general, para este estudio, la diversidad alélica en las localidades del flanco oriental de la cordillera Centro-oriental fue baja, contrario a lo encontrado por Zimmermann et al. (2011), con un tamaño poblacional pequeño. Así mismo, los análisis de diferenciación indican la presencia de estructura genética espacial, lo que sugiere que la dispersión de las poblaciones de E. smaragdina es dependiente de las barreras geográficas (presencia de la cordillera), pero principalmente ecológicas (requerimientos de la especie), lo que aporta a la variabilidad genética, tanto entre poblaciones como dentro de ellas. En este sentido, la variabilidad dentro de las poblaciones podría explicarse debido a que la mayoría de las especies fuente de fragancias (orquídeas y aráceas, entre otras) para los machos de euglosinos tienen una vida relativamente corta, es decir, son atractivas y disponibles a los polinizadores por muy poco tiempo. Además, tienen una distribución extensa en el espacio, lo que “obliga” a que los machos de euglosinos, recolectores de fragancias, tracen rutas imaginarias de vuelo regulares entre 40-45 ha, estableciendo a lo largo de las rutas territorios de exhibición reproductiva en rangos de acción amplios, por lo que se mueven y habitan por periodos de tiempo lo que en ecología se conoce como área de vida (home range) (Pokorny et al., 2015).

Frankham (2003) y Suni y Brosi (2012) consideran que el intercambio de individuos entre subpoblaciones (migración) favorece un flujo génico suficiente para mantener la diversidad genética en niveles similares a una población contigua y disminuir la diferenciación genética. Al reemplazar los alelos perdidos por deriva génica se mitiga la depresión por endogamia. Diversos estudios muestran que las hembras de Euglossini son filopátricas, es decir, que, contrario a lo que ocurre con los machos, ellas están generalmente ligadas a sus sitios de anidación y dependen de la disponibilidad suficiente de néctar y polen para sostenerse y aprovisionar las celdas de cría. Esto respalda la idea de que el intercambio de flujo génico en abejas de las orquídeas es, en su mayoría, debido a la dispersión de los machos (Andrade & Nascimento, 2012; Augusto & Garófalo, 2004).

Suni et al. (2014) y Suni y Brosi (2012) sugieren que la capacidad de vuelo no es un factor que defina las dinámicas de dispersión en algunas especies de Euglossini. En estudios de marcaje y recaptura se ha demostrado que los machos de Exaerete, Eulaema y Eufriesea, pese a su capacidad de vuelo y a tener amplios rangos de acción como área de vida, presentan altos niveles de fidelidad a sus áreas natales. En ambos estudios, se concluye que los niveles de diferenciación entre poblaciones de algunas especies de Euglossini pueden deberse a procesos de transformación paisajística o geomorfológica o ser un reflejo de la dispersión natural y las distancias de forrajeo de cada especie, pues la movilidad de las abejas de las orquídeas difiere fuertemente entre especies.